摘要：对前期利用抑制消减杂交技术（Suppressive subtractive hybridization， SSH）构建的紫云英（Astragalus sinicus）根部组织的共生固氮差异表达cDNA文库进行了全文库测序和初步分析，并利用半定量RT-PCR方法验证了其中5个基因片段在根瘤中的下调表达。结果表明，从180个克隆中共获得94个有效序列，文库插入片段长度为200～1 300 bp。BLAST同源比对分析结果表明，有90个序列可以找到同源片段，有4个可能为新基因，按功能分为10个类群。

 

　　关键词：紫云英（Astragalus sinicus）；共生固氮；抑制消减杂交；下调表达基因

 

　　中图分类号：S541+.3；Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1684-06

 

　　Isolation and Analysis of Down-regulated Symbiotic Nitrogen Fixation Genes in Astragalus sinicus Root Nodules

 

　　LI Yi-xing， WU Mei， LI You-guo

 

　　（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

 

　　Abstract： In previous work， a cDNA library of Astragalus sinicus genes related with symbiotic nitrogen fixation was constructed with suppressive subtractive hybridization（SSH）. The library containing down-regulated genes was sequenced and analyzed. Among the sequenced genes， five fragments were sckeened and its down-regulated expressions were confirmed by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that 94 genes were obtained from 180 clones and the average length of inserted fragments was 200～1 300 bp. Nucleotide BLAST homological analysis showed that 90 genes had similarities to known genes and 4 genes were putatively novel genes. All the 94 genes were divided into 10 functional categories.

 

　　Key words：Astragalus sinicus； symbiotic nitrogen fixation； suppressive subtractive hybridization； down-regulated gene

 

　　根瘤菌和豆科植物可以共生固氮，共生固氮是一个二者相互识别、相互作用的复杂过程。根瘤的形成以及根瘤菌的入侵、分化和发育离不开植物基因的参与和调控[1]。这种调控涉及多种代谢途径和信号传递过程，有多个基因参与。对共生固氮过程中基因表达情况进行全局性的研究，可以发现并鉴定出更多与根瘤形成和固氮过程相关的基因，有助于建立共生固氮的调控网络。如研究者从蒺藜苜蓿中鉴定出756个与根瘤形成和固氮相关的差异表达基因，其中313个基因上调表达，而443个基因则下调表达[2]。Lohar等[3]也从苜蓿中检测出在根瘤菌感染的1～72 h内各阶段上调或下调表达的基因。抑制消减杂交技术是一种以mRNA差异显示为基础的筛选差异表达基因技术，已被广泛应用于植物差异表达基因的研究。Fan等[4]利用抑制消减杂交技术筛选出火龙果中与干旱胁迫相关的基因；Guo等[5]采用抑制消减杂交从胡椒中鉴定出73个在低温胁迫下可能受脱落酸调控的基因；韩明鹏等[6]构建了紫花苜蓿高温胁迫条件下的抑制消减杂交文库，用来筛选高温诱导表达的基因。抑制消减杂交技术同样是研究共生条件下差异表达基因的有效手段。Clement等[7]构建了干旱条件下大豆根瘤的抑制消减杂交文库，并从中鉴定出一批与干旱条件下根瘤的固氮功能相关的新基因。Godiard等[8]通过抑制消减杂交技术筛选出52个在根瘤菌-苜蓿共生固氮过程中起调控作用的基因。

 

　　紫云英（Astragalus sinicus）是一种主要分布于中国、日本和韩国等东南亚国家的豆科绿肥。它和华癸中慢生根瘤菌共生，形成不定型根瘤，二者的共生具有严格的宿主专一性，是研究共生固氮的好材料[9]。前期工作中Chou等[10]构建了紫云英根瘤的正向和反向抑制消减杂交文库，并通过上调文库鉴定出16个共生条件下增强或诱导表达的新基因。相对于上调表达基因，下调表达基因同等重要，本研究对前期构建的下调文库进行了全文库测序，并对测序结果进行了同源比对分析，为后续基因功能的研究提供参考。

 

　　1 材料和方法

 

　　1.1 材料

 

　　华癸中慢生根瘤菌7653R（Mesorhizobium huakuii 7653R）为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室固氮室保存。RNA抽提所用Trizol试剂购自Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶、DNaseⅠ、Reverse Transcriptase M-MLV均购自Takara大连有限公司。

 

　　1.2 方法

 

　　1.2.1 植物培养及结瘤 将紫云英种子用70%乙醇处理5 min，再用3%NaClO处理10 min，然后用无菌水洗涤5～6次，将消毒后的种子用无菌水浸泡2 h后，平摊于含有0.5%蔗糖和1.2%琼脂的平皿上，置于光照培养箱中22 ℃培养。待胚根长至1 cm左右时，将种子接种于无菌沙钵中培养，子叶展开后接种华癸中慢生根瘤菌7653R。所有植株均用无氮营养液浇灌。

 

　　1.2.2 总RNA的提取和cDNA合成 接种根瘤菌7653R后26 d，收集根瘤、去除根瘤的根和未接种植株的根，用Trizol试剂提取根瘤组织总RNA，经DNaseⅠ处理后，用紫外分光光度计测定其纯度和浓度，然后用DEPC水将各样品RNA浓度调整到一致。取3 μL总RNA，以Oligo dT18为引物，反转录酶Reverse Transcriptase M-MLV反转录得到cDNA，以5′-ATGCAGATCTTTTGTGAAGAC-3′和5′-ACCACCACGGAAGACGGAG-3′为引物， 进行PCR 扩增保守基因泛素序列，以验证cDNA合成是否有效。

 

　　1.2.3 半定量RT-PCR 分别以根瘤、去除根瘤的根和未接种植株的根的cDNA为模板，用基因特异性引物扩增AsG6、AsC2、AsB3、AsT6、AsD5这5个基因片段，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，进行半定量分析，以232 bp的18S rRNA 基因片段为内参。所用引物序列见表1。

 

　　1.2.4 序列分析 目的基因氨基酸序列推测及比对利用BioEdit软件进行。同源比对利用BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http：//ca.expasy.org/）进行。氨基酸保守结构域采用InterProScan （http：//www.ebi.ac.uk/）和Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/）数据库进行分析。

 

　　2 结果和分析

 

　　2.1 文库序列的聚类分析

 

　　将下调文库进行全文库测序，共获得94个有效序列，插入片段的大小在200～1 300 bp。将所有序列利用BLAST程序进行同源序列比对（表2），结果发现有90个序列可以找到同源片段，同时有4个序列在数据库中找不到同源片段，推测这4个序列可能代表新的基因。以上94个有效序列对应81个基因，按其编码蛋白的功能分为10个类群（图1）：核糖体蛋白9个，信号转导相关蛋白7个，基因表达相关蛋白12个，代谢相关蛋白20个，膜及转运相关蛋白11个，细胞应激防御相关蛋白8个，未知蛋白6个，假定蛋白3个，无同源性蛋白4个和1个其他蛋白。

 

　　2.2 半定量RT-PCR验证

 

　　在测序得到的94个基因片段中，分别选取过氧化物酶、热激蛋白、C3HC4型锌指蛋白、假定蛋白和质体蓝素蛋白5个基因片段AsG6、AsC2、AsB3、AsT6、AsD5（表2）对其下调表达进行验证。提取接种后26 d的紫云英根瘤、感染根和未接种对照根的总RNA，进行半定量RT-PCR分析。以232 bp的18S rRNA 基因片段为内参，检测5个目标基因的半定量结果。由图2可知，与未接种的根相比，这5个基因在根瘤中的表达量大大降低，呈明显的下调表达特征，这说明文库的结果是可靠的。