摘要：多酚氧化酶（PPO）是酶促褐变的关键酶，以余甘子（Phyllanthus emblica）果实PPO为研究对象，采用分光光度法研究余甘子果实PPO作用的最适底物，同时探究反应体系pH、反应温度、底物浓度、抑制剂对余甘子果实中PPO活性的影响。结果表明，余甘子果实PPO作用的最佳底物为焦性没食子酸，最适pH为6.0，最适反应温度为10 ℃，底物最佳浓度为0.14 mol/L，抗坏血酸（VC）、柠檬酸、亚硫酸钠、L-半胱氨酸4种抑制剂对余甘子果实PPO活性均表现出不同程度的抑制作用，其中抗坏血酸对余甘子果实PPO活性抑制效果最好。

 

　　关键词：余甘子（Phyllanthus emblica）；多酚氧化酶（PPO）；活性；抑制剂

 

　　中图分类号：R284.1；Q946.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1621-04

 

　　Factors Affecting Activities of Polyphenol Oxidase in Phyllanthus emblica

 

　　ZHENG Li-ping，QIU Chun-xiu，CHEN Xiao-hong，WANG Hui-min，ZHANG Fu-ping

 

　　（Department of Biology， Hanshan Normal University， Chaozhou 521041， Guangdong，China）

 

　　Abstract： Polyphenol oxidase（PPO） was the key enzyme of enzymatic browning. The optimal substrate to PPO of Phyllanthus emblica and effects of pH，temperature，concentration of substrate and inhibitor on PPO activity were studied with spectrophotometry. The results showed that the optimal substrate was pyrogallic acid. The optimal pH， temperature and concentration of substrate were 6.0， 10 ℃ and 0.14 mol/L， respectively. Vitamin C， citric acid， Na2SO3 and L-Cysteine had inhibition effects on PPO activity in different degree. Vitamin C had the best inhibition effect on PPO activity in the fruit of phyllanthus emblica.

 

　　Key words： Phyllanthus emblica； polyphenol oxidase（PPO）； activity； inhibitor

 

　　余甘子（Phyllanthus emblica）属大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属植物，其果鲜食酸甜酥脆而微涩，初食味酸涩，良久乃甘，故名“余甘子”。余甘子树耐旱耐瘠，适应性强，喜光喜温，一般树高1～3 m，单果重15 g左右。研究表明，余甘子果实中含有丰富的超氧化物歧化酶、维生素C、多酚类物质及多糖等活性物质[1]。余甘子果实味酸微涩，清热凉血，消食健脾，生津止渴。主治血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛、口干及维生素C缺乏症。在藏药中，余甘子主治培根病、赤巴病、血病、高血压病等[2]。近年研究结果表明，余甘子具有抗炎、抗氧化、抗衰老、保肝等作用[3]，而其强烈的抗氧化活性是其生理功能的基础[4]。果实采后褐变会直接影响果实的品质和商品价值。果蔬采后的褐变主要是多酚氧化酶（PPO）引起的，多酚氧化酶是一类含Cu元素的膜结合蛋白，它催化果蔬体内的多酚类物质氧化形成醌，后者自身缩合或与细胞内蛋白质结合，形成褐色或黑色物质。对于余甘子果实的保鲜，关键就在于抑制PPO的活性。目前已有许多试验研究了不同果实中的PPO[5-14]，而对于余甘子的相关研究报道则较少。本试验对余甘子果实PPO活性的影响因素进行了探究，旨在为其采后的保鲜与加工提供理论依据。

 

　　1 材料与方法

 

　　1.1 材料、试剂与仪器

 

　　材料：余甘子果实（普通品种）购自广东潮州市农贸市场。

 

　　试剂：柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸（VC）、亚硫酸钠、L-半胱氨酸、焦性没食子酸、邻苯二酚、对苯二酚、间苯二酚、磷酸、醋酸等均为分析纯。

 

　　仪器：PHS-3CA型精密酸度计（上海大中分析仪器厂）；UV-2800型紫外分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]；电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；恒温干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）；16R型高速冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（江苏金坛亿通电子有限公司）。

 

　　1.2 方法

 

　　1.2.1 PPO酶液的提取 将新鲜、无机械损伤、无病虫害的余甘子果实洗净，然后取10 g余甘子果肉，加入预冷的0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸盐缓冲液10 mL于低温（冰水中）捣碎至匀浆，6 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液，低温（0～4 ℃）保存。

 

　　1.2.2 最佳底物选择试验 将各种酚类物质（焦性没食子酸、邻苯二酚、对苯二酚、间苯二酚）分别用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸盐缓冲溶液配制成0.1 mol/L溶液作为PPO作用的底物。取底物溶液11.2 mL，加入PPO粗酶提取液0.8 mL，摇匀，于25 ℃保温5 min，加入50 μL浓盐酸终止反应。在420 nm波长下测定其吸光度（A）并计算PPO相对活性，以确定余甘子果实PPO作用的最佳底物。

 

　　1.2.3 PPO活性测定 采用晏绍庆等[11]的测定方法并稍作修改。将“1.2.2”中选出的最佳底物焦性没食子酸用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸盐缓冲溶液配制成0.1 mol/L的溶液作为酶的底物，取底物溶液11.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL，于25 ℃下保温5 min，加入50 μL浓盐酸终止反应。然后在波长420 nm处比色，测定吸光度A，计算PPO的活性。以每毫升酶液反应后每分钟吸光度值增加0.001定义为1个酶活单位（U）。

 

　　PPO活性=ΔA420 nm×VT/（W×VS×0.001×t）

 

　　式中，ΔA420 nm为样品吸光度与空白对照吸光度之差，VT为提取酶液总体积（mL），W为待测材料质量（g），VS为测定时取用酶液体积（mL），t为反应时间（min）。PPO活性单位为U/（g·min）。

 

　　1.2.4 pH对PPO活性的影响 取0.1 mol/L的焦性没食子酸11.2 mL作为底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，调整反应体系的pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），在25 ℃下保温5 min，加入50 μL浓盐酸终止反应。按照“1.2.3”的方法测定PPO活性。

 

　　1.2.5 反应温度对PPO活性的影响 取0.1 mol/L的焦性没食子酸11.2 mL作为底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，调整反应体系的pH为6.0，在不同的温度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）下保温5 min，加入50 μL浓盐酸终止反应。按照“1.2.3”的方法测定PPO活性。

 

　　1.2.6 底物浓度对PPO活性的影响 取不同浓度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mol/L）的焦性没食子酸11.2 mL作为底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，调整反应体系的pH为6.0，于25 ℃下保温5 min，然后用50 μL浓盐酸终止反应。按照“1.2.3”的方法测定PPO活性。

 

　　1.2.7 抑制剂对PPO活性的影响 将抑制剂抗坏血酸（VC）、柠檬酸、亚硫酸钠、L-半胱氨酸分别用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸盐缓冲溶液配制成0.02 mol/L的溶液，分别取上述抑制剂2.0 mL，加入焦性没食子酸（0.14 mol/L）溶液9.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL。在25 ℃下保温5 min，加入50 μL浓盐酸终止反应。按照“1.2.3”的方法测定PPO活性。

 

　　2 结果与分析

 

　　2.1 最佳底物选择试验结果

 

　　由图1可知，以焦性没食子酸为底物时余甘子果实PPO活性最大，即焦性没食子酸是余甘子果实PPO作用的最佳底物。

 

　　2.2 pH对余甘子果实PPO活性的影响

 

　　由图2可知，余甘子果实PPO作用的最适pH为6.0，在pH小于3.0和大于9.0时，果实的PPO活性受抑制的趋势越来越明显。这是因为PPO是一种含Cu离子的蛋白质，在强酸条件下，Cu离子被解离出来使酶失活，而且较高的酸性也使蛋白质变性导致酶失活；在碱性条件下，Cu离子与酶蛋白脱离，生成不溶性的Cu（OH）2，也可使酶失活。因此，在进行果品加工处理时，可调节环境的pH，使果实PPO失活，从而减轻其褐变的发生率。

 

　　2.3 反应温度对余甘子果实PPO活性的影响

 

　　反应温度对PPO活性的影响如图3所示。由图3可以看出，反应温度在0～60 ℃时，余甘子果实PPO活性呈现先上升后下降的趋势，0～10 ℃范围内，随着温度的上升，余甘子果实PPO活性上升迅速；10～30 ℃时，随温度升高余甘子果实PPO活性下降明显，当温度高于30 ℃时，余甘子果实PPO活性变化不大，处于较低水平。余甘子果实PPO活性的峰值出现在10 ℃，即PPO作用的最适温度为10 ℃，这与纪淑娟等[14]报道的蜜柚PPO作用的最适温度为10 ℃相一致。但在0 ℃时发现余甘子有冻伤现象，所以0 ℃不宜作为其贮存的温度。

 

　　2.4 底物浓度对余甘子果实PPO活性的影响

 

　　由图4可知，在供试反应体系中，当焦性没食子酸浓度为0.02～0.14 mol/L时，余甘子果实PPO活性呈上升趋势，且在0.14 mol/L时达到最大；当焦性没食子酸浓度为0.14～0.20 mo1/L时，余甘子果实PPO活性的变化趋于平缓。这是因为底物浓度较低时，有一些酶的活性部位并没有与底物结合，随着底物浓度增加，越来越多的酶活性部位与底物相结合，使酶促反应进行；在达到一定浓度后，所有的酶活性部位都与底物结合，此时酶活性部位被底物饱和，进一步提高底物浓度也不能提高酶活性，酶活性达到最大值。

 

　　2.5 抑制剂对余甘子果实PPO活性的影响

 

　　由图5可以看出，4种抑制剂对余甘子果实PPO活性均表现出不同程度的抑制效果。其抑制效果由强到弱分别为抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、柠檬酸。抗坏血酸对余甘子果实PPO活性的抑制效果好于其他3种。抗坏血酸等4种抑制剂可以作为醌的还原剂，也可以作为酶分子中Cu离子的螯合剂，能够与酶促褐变的中间产物生成稳定无色的产物，阻止了黑色素的生成，从而抑制了PPO的活性。