玉米穗行数基因的QTL定位与分析(2)

　　选择玉米公共遗传图谱 IBM Neighbors 2005上已公布的、位于bnlg1083～bnlg1811之间得的所有SSR标记，筛选在综3和衡白522间具有多态性的标记。由于公共遗传图谱上可供利用的标记有限，且多态性不足，利用已公布的玉米自交系B73基因组序列开发更多的、新的标记。SSR标记开发的具体方法如下：从公共网站上 www.maizesequence.org上下载区段内的B73的基因组序列，利用网站www.gramene.org提供的SSRIT工具寻找序列中的简单重复序列，对所搜寻到的简单重复序列位点，逐个提取简单重复序列位点前后约 200 bp 的序列，软件Primer 5.0用于SSR分子标记的引物设计，选择扩增产物大小150～250 bp的引物，交由上海生工合成。新开发标记的引物以HND标示。
　　1.4QTL定位
　　利用在亲本间具有多态性的SSR分子标记鉴定分离群体的基因型，使用软件MAPMAKERNT、Kosambi函数，构建区段内遗传连锁图谱；将群体的基因型和穗行数的表型数据结合，利用软件WINQTLCART2.5，设置成排列测验1 000次，复合区间作图，进行QTL的定位和效应分析。
　　2结果与分析
　　2.1多态性标记的筛选与开发
　　研究利用的置换系SIL8的导入片段在第一染色体的分子标记bnlg1083和bnlg1811之间，将玉米公共图谱IBM Neighbors 2005上在这2个标记之间的所有SSR标记于亲本间筛选多态性。合成的SSR标记有45个，在亲本之间具有多态性的标记有19个，即多态性标记比率为 42.20%。随后，利用玉米公共网站www.maizesequence.org上的序列信息，将初步定位区间的序列下载，其物理距离约为10 Mb，含有86个BACs。开发的标记数为119个，新开发的标记中在亲本间有多态性的36个，占总开发标记的30.25%，表明综3和衡白522这2个玉米自交系间的基因组差异较大，多态性标记的开发效率较高。在群体中有较好分离用于群体基因型检测的有12个，占总开发标记的10.08%。条带清晰、有多态性（图1-A）和无多态性（图1-B）的SSR分子标记检测见图1。
　　2.2遗传连锁图谱的构建
　　利用SIL8和综3杂交构建的区段（bnlg1083～bnlg1811）内F2次级分离群体，分子标记检测得到的单株基因型进行遗传连锁图谱的构建。2008年，利用保定种植的分离群体（BC4F2）253个单株基因型、15个标记来绘制区段的遗传连锁图谱见图2（左），遗传距离总长度为 103.2 cM，2个标记最短间距为2.4 cM，最长间距为14.8 cM，平均间距为7.37 cM，标记分布较均匀。2009年，根据2008年初步定位结果，在缩小的区段内进行新的标记的开发和多态性的筛选，利用分离群体（BC5F2）577个单株基因型、15个标记来构建遗传连锁图谱。从图2（右）可知，遗传距离总长度为12.6 cM，最短间距达到0.1 cM，最长间距仅2.9 cM，平均间距为0.9 cM，标记密度比较高。
　　2.3穗行数QTL的定位
　　2008年，在保定种植分离群体材料，得到180个单株的穗行数表型值，结合群体基因型数据，利用WINQTLCART 2.5软件设置为步长2 cM，排列测验1 000次，复合区间作图法，进行了穗行数QTL的初步定位分析。根据定位结果（图3-A），在标记umc1044和umc2096之间有2个比较明显的峰，将目标区段由103.2 cM缩小到29 cM，LOD阈值为3.7，其中
　　左边峰的LOD值为4.8，右边的比较尖一点的峰的LOD值为5.2，贡献率（R2）达到11%，初步鉴定为主效的穗行数QTL，以加性效应为主。在穗行数QTL初步定位的基础上，开发定位区间内新的分子标记和筛选其在亲本间的多态性并选择在群体中分离较好的标记。2009年，种植较大的分离群体，最终得到577个单株的穗行数表型值，结合15个标记基因型，开展穗行数QTL的精细定位。定位软件WINQTLCART 2.5设置为步长0.5 cM，排列测验1 000次，复合区间作图法。
　　从图3-B看出，2009年穗行数QTL的定位结果在区间内同样出现明显的峰，与2008年定位结果相比，位置大致相同，定位区间进一步缩小。经排列测验得LOD阈值为2.0，第1个峰几乎与标记HND9所处位置相同，第2个峰在标记 HND109～umc1397之间，遗传距离为0.7 cM，LOD值为4.9，第3个峰处于标记HND123～umc1479之间，遗传距离为1.8 cM，LOD值为4.7，贡献率（R2）为7%，以加性效应为主。
　　与此同时，利用2008年分离群体中的交换单株，选择在定位区间内杂合的单株自交，于2009年标记筛选出了11个跨叠系的纯系材料（图 4），并对纯系材料进行了穗行数的考察。构建的11个跨叠系结合各系穗行数表型值，可以看出，具有HND9～umc1397标记之间片段的纯系穗行数为8 行或10行，不具有该片段的纯系穗行数为14行，该片段与2009年定位结果中的前2个峰所处位置一致。
　　3讨论

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