通脉颗粒在急性心肌缺血模型比格犬体内药动学研究(3)

　　2.2.2 线性配制各待测成分质量浓度为2.5，5，10，25，50，250，500 μg·L^-1的犬对照血清样品，以2.1.3项下方法操作，以2.1.4项下条件进样分析。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法（weighting factor，l/X）进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线，包括每种成分的线性范围、定量下限、回归曲线方程和相关系数，结果见表2。
　　2.2.3 精密度和准确度取犬空白血浆，外加各待测成分配置成标准曲线范围内低、中、高浓度（5，50，250 μg·L^-1）的质量控制（QC）样品，以2.1.3项下操作，平行操作5样本，根据当日标准曲线，分别计算QC样品的测得浓度，以测定值的RSD考察测定方法的精密度。测定值与配制浓度对照，求得测定方法的准确度。测定方法的准确度和精密度结果见表2。各成分测定浓度的RSD除丹参素（DSS）在低浓度时为 17.9%，其他所有成分的低、中和高浓度均小于15%，准确度85%～115%，表明测定方法精密度及准确度可以满足生物样本分析实验要求。
　　2.2.4 提取回收率取犬空白血清配制待测成分浓度为标准曲线线性范围低、中、高3种质量浓度（5，50，250 μg·L^-1）的QC样品，以2.1.3项下方法操作，每一浓度进行5样本分析。以峰面积与相同浓度标准溶液的峰面积比值计算提取回收率。经测定，各成分平均提取回收率在30%～80%，各待测成分高、中、低浓度下的提取回收率基本一致。
　　2.2.5 基质效应取来源于不同犬的空白血清，以2.1.3项下方法操作，制备空白血清基质提取液，然后用此基质提取液配制低、中、高3个质量浓度（5，50，250 μg·L^-1）的样品；另外配制相同浓度的对照品溶液，每一浓度进行5个样本分析。结果显示大部分成分的基质效应在85%～115%，而SAB，TMF1及TM6的基质效应在78%～85%，但是在高、中、低浓度间的一致性良好。
　　2.3 通脉颗粒在急性心肌缺血模型比格犬中的药代动力学研究
　　2.3.1 急性心肌缺血模型的制备动物经戊巴比妥钠（30 mg·kg^-1）静脉麻醉，气管插管，连接电动呼吸机；左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包床；分离冠状动脉前降支中段，穿线以备结扎，造成急性实验性心肌缺血模型，实验期间描记心外膜电图。
　　2.3.2 给药和样品采集实验模型建立成功采集数据后，经十二指肠注射6 g·kg^-1通脉颗粒，造模前、造模后和给药后5，10，20，40，60 min，1.5，2，3，4，6 h采静脉血。每个时间点采集的血液用4 mL冻存管收集，静置1 h后离心（3 000 r·min^-1，20 ℃，10 min），收集上层血清样品，置于超低温冰箱（-80 ℃），保存至分析。
　　2.3.3 比格犬血清样品分析对各时间点血清样品以2.1.3项下前处理后以2.1.4项下方法进行LC-MS/MS分析。在急性心梗模型的比格犬十二指肠给予TM 5 min后，药物成分即吸收入血，15种多酚成分均能在6 h内检出。对浓度超出最高检测浓度的样品以空白血清稀释至检测范围后测定。测定结果显示各成分的浓度差异很大，其中含量最高的5种成分依次为是葛根素（TMF10）、丹参素（DSS）、3′-甲氧基葛根素（TMF7）、芹糖基葛根素（TMR2）和3′-羟基葛根素（TMR3）。体内以葛根异黄酮类为主，除丹参素外的其他丹参成分及川芎成分的血药浓度相对较低。各成分在3种给药剂量下的时间-浓度曲线见图2。
　　2.3.4 TM成分在急性心肌缺血比格犬体内的药动学分析由于急性心肌缺血模型动物生存时间所限，血样只能取至6 h，不能获得更完整的药时曲线。由于6 h时各成分基本刚进入消除相，因此在对参数分析时未能获得消除半衰期数据，只计算了与暴露程度相关的药代参数。依据LC-MS/MS分析获得的15种体内多酚成分的时间-浓度数据，对TM各成分的达峰时间、峰浓度采用实际测定值，以梯形法计算曲线下面积，分析结果见表3。阿魏酸达峰极快，其次是丹参的酚酸类成分和葛根中的葛根素、大豆苷和大豆苷元，芒柄花素则为达峰最晚的成分。从这些成分的药时曲线特征中可以看到2种苷元，芒柄花素和大豆苷元，在2～6 h有出现浓度再次上升的趋势，这可能因为多种黄酮在体内能够逐渐代谢转化成苷元，造成再次达峰。丹参素和葛根素在犬体内暴露量最高，远高于其他成分。
　　3 讨论
　　中药成分复杂，血药浓度低，生物分析方法的建立一直是复方中药药代研究中的难点。LC-MS具有灵敏、专一的检测特点，适用于多成分的高灵敏分析要求。但是LC-MS受到生物样品基质的影响很大，严重影响灵敏度及方法可靠性，同时生物样品中的蛋白成分也会对分析柱造成损害，这要求在分析前，需要适当的样品前处理方法。常规的去除蛋白的方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法，针对不同样品选用不同方法。本实验由于成分众多，成分间极性差别较大。尝试了市售的多种类型固相萃取产品，但是各成分在萃取柱上吸附特性差别较大，难以达到所有待测成分的同时洗脱。蛋白沉淀法特异性不强，较符合本实验多成分，极性差异大的特点，但经过试验，发现存在很强的基质效应。在对液液萃取法进行优化过程中，经过对不同萃取剂的比较，最终选定的酸化后萃取的方法可以同时提取15种待测物。多酚类成分易被氧化而提取过程发生降解，加入抗抗坏血酸极大提高了提取过程中待测成分的稳定性。
　　建立液相分离方法时同样需要解决不同极性成分共同分析的问题。这些待测多酚成分有一些是同分异构体，且在通脉颗粒中也可能存在未知的同分异构体及因体内代谢转化形成的同分异构代谢物，这给生物样本分离方法的建立造成很大困难。对几种分析柱的比较后，实验选用了整体硅胶柱来分离多酚类成分。这种分析柱具有柱效高、柱压低的显著特点，可提高分析速度，且能改善酚酸类的拖尾现象。经对梯度洗脱条件的优化，最终实现了15种待测多酚成分特异性的快速分离。
　　冠状动脉结扎急性心肌缺血模型犬是考察活血化瘀药物的经典药效模型，但由于是急性创伤性造模，期间动物处于麻醉状态，动物这种生理状态下可能与清醒状态的药动性质不完全一致，但是本研究重在比较多成分间药动性质的差异，寻找主要体内暴露成分，选用动物模型更有说明性。且在该模型下可以同时考察药效和药动性质，是首选的活血化瘀药物PK-PD研究模型。由于造模后生理状态的影响不能采血过长，6 h的采血时长很难反应药物的消除相，因此无法分析更全面的药代参数。但是从目前获得数据能够获得入血成分的体内暴露、随时间的变化等信息，这些信息对后续的 PK-PD分析，解析药效物质基础是非常重要的。

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